Dış Kaynaklı Proje Süreçleri Yönetim Sistemi
Cansev A. (Araştırmacı), Gülen H., Cevher keskin B.
Zeytin (Olea europaea L.) bitkisi değişik çevresel koşullara adaptasyonunun yüksek olması
sebebiyle geniş bir yayılım alanına sahip olmasına rağmen, özellikle son yıllarda yetiştiricilik
yapılan bazı bölgelerde oluşan ani ve ekstrem sıcaklık düşüşleri ve don zararı nedeniyle önemli
verim ve kalite kayıpları oluşmaktadır. Bu nedenle zeytinde yetiştiriciliği yapılan mevcut çeşitlerin
don toleranslarının belirlenmesine ve toleransı yüksek çeşitlerin geliştirilmesine mutlak ihtiyaç
vardır. Zeytin gen kaynaklarının don stresi toleransı bakımından taranması (screening) ve don
toleransıyla ilişkili haritalama ile don stresine toleransın karbonhidrat, protein ve gen düzeyinde
araştırılmasını kapsayan bu çalışma, üç alt proje halinde yürütülmüştür.
Birinci alt projede İzmir ilinin Kemalpaşa ilçesinde bulunan Zeytin Arazi Gen Bankası’nda (ZAGB)
yer alan ve tescil edilmiş 90 çeşide ait bir yıllık sürgünlerden toplanan yaprak örneklerine aktif
(Temmuz ayı) ve durgun (Ocak ayı) dönemlerde laboratuvar koşullarında kontrollü don testleri
uygulanmıştır. Tüm örneklerde sıcaklık 4 ºC’den itibaren kademeli olarak -20 ºC’ye kadar
düşürülerek iyon sızıntısı yöntemiyle tüm çeşitlerin hücre zarı zararlanmasına bağlı olarak don
toleransı dereceleri (LT50) hesaplanmıştır. Çeşitler don toleransı bakımından gruplandırıldığında;
4 çeşit yüksek toleranslı (LT50 -20,20 o
C - -18,57 o
C), 12 çeşit toleranslı (LT50 -18,02 o
C - -16,83
o
C), 28 çeşit orta derecede toleranslı (LT50 -16,53 o
C - -15,14 o
C), 33 çeşit hassas (LT50 -15,11 o
C
- -13,46 o
C) ve 13 çeşit çok hassas (LT50 -13,34 o
C - -11,5773 o
C) olarak tespit edilmiştir. Ayrıca
zeytinde soğuk uyumu (aklimasyon) modellemesi oluşturulmuştur. Zeytinde soğuk
aklimasyonunun oldukça önemli olduğu, ağaçların belirli bir süre düşük sıcaklıklara maruz
kalmasının don mukavemetini önemli derecede arttırdığı, ancak bu durumun sürekli (stabil)
olmadığı ve uyumun adaptasyonun gerçekleşemediği sıcaklığa dönüldüğünde hızlıca
kaybedilebileceği belirlenmiştir. Zeytinde don toleransını kontrol eden genlerin kromozomlar
üzerindeki yerlerinin belirlenmesi amacıyla laboratuvarda kontrollü koşullarda don testleri
uygulanan Memecik x Uslu melezlerinin (104 genotip) yaprak dokularında bağlantı (QTL -
Kantitatif karakter lokusu) ve ilişkilendirme (Association) haritalama çalışmaları yapılmıştır.
Zeytinde yapılan diğer birçok linkage haritalarına göre markör doygunluğu oldukça yüksek bir
linkage haritalama gerçekleştirilmiştir. Anne ebeveyn (Memecik) için zeytinin haploid kromozom
sayısı olan 23, baba ebeveyn (Uslu) için ise 26 linkage grubu belirlenmiştir. ‘Memecik’ çeşidi için
4377 markör, Uslu çeşidi için ise 4664 markör haritalanmıştır. Her iki ebeveynde haritalanan
markör sayısı toplam 9041 olarak gerçekleşmiştir. ‘Memecik’ çeşidinde, don toleransı ile ilişkili
LOD≥3 değerine sahip 2 aday QTL bölgesi belirlenmiştir. Bu markörler LG10’da 58,639 cM ve
54,894 cM bölgesinde saptanmışlardır.
İkinci ve üçüncü alt projelerde ise, önceki çalışmalardan elde edilen sonuçlara göre dona nispeten
hassas ‘Çelebi (İznik)’ çeşidi ve toleranslı ‘Memeli’ çeşidine ait bir yıllık fidanlar kontrollü büyütme
kabininde -20 ºC’ye kadar kademeli don stresine maruz bırakılmış ve takiben alınan yaprak örneklerinde protein, karbonhidrat ile gen ifade ve dizileme analizleri yapılmıştır. İyon sızıntısı
testine göre dona hassas olan ‘Çelebi (İznik)’ çeşidinde hücre zarı zararlanma oranı ‘Memeli’
çeşidinden istatistiki olarak yüksek olmuştur. Her iki çeşitte de -8o
C’ile birlikte zararlanma oranında
hızlı bir yükselme görülmüştür. Sıcaklık düşüşüne bağlı olarak toplam protein içeriği ‘Çelebi (İznik)’
çeşidinde kontrole göre azalmış ‘Memeli’ çeşidinde ise özellikle -8 ºC’den sonrasında artmış ve
-20 ºC’de dahi kontrol seviyesinde kalmıştır. Yaklaşık 66 ve 45kDa arasındaki proteinlerde
çeşitlere ve sıcaklıklara göre farklılıklar tespit edilmiştir. LC-MSMS (Sıvı kromatografisi-kütle
spektrometrisi) aracılığıyla protein dizileme analizleri sonucuna göre DLP (Defensin-like protein)’in
ekspresyonunun don stresiyle beraber ‘Memeli’ çeşidinde artması, DLP’nin don stresine
toleransta önemli rolü olduğunu göstermiştir. Don stresi ile birlikte ifadesi değişen genlerin
belirlenmesi amacıyla yürütülen RNA dizileme (RNAseq) teknolojisi aracılığıyla transkriptom
profilleme çalışmaları sonucu, don toleransı düşük ve yüksek olan iki çeşit arasında, istatistiksel
öneme sahip farklılık gösteren çok sayıda transkript ve gen bulunmuştur. Özellikle Auxin-induced
22D-like protein, Late blight resistance homolog R1B-17 proteini ve Kirola-like protein genlerinin
ifadelerinin Memeli çeşidinde -8 o
C’de; Zea geninin ise -4 o
C önemli derecede artış göstermesi bu
genlerin don toleransında etkili olduğunu ortaya koymuştur.
Üçüncü alt proje kapsamında; don stresine maruz kalan ‘Çelebi (İznik)’ ve ‘Memeli’ çeşitlerine ait
yaprak örneklerinde karbonhidrat metabolizmasında yer alan sukroz (Suc), fruktoz (Fru), glikoz
(Glc), galaktoz (Gal), rafinoz (Raf), staçiyoz, trehaloz (Tre), maltoz gibi metabolitler ve nişasta
miktarlarındaki değişimler belirlenmiştir. Karbonhidrat metabolizması enzimlerinden invertaz
(INV), sukroz sintaz (SS), sukroz fosfat sintaz (SPS), heksokinaz (HXK), fruktokinaz (FRK),
galaktinol sintaz (GOLS), rafinoz sintaz (RS), trehaloz-6 fosfat sintaz (T6P) ve β-amilaz (BAM)
aktivitelerindeki değişimler ve bu enzimleri kodlayan genlerin ifade düzeyleri belirlenmiştir.
Sonuçlar, Suc, Fru, Gal ve Raf'ın zeytin bitkisinde don toleransının sağlanmasında daha önemli
rolü olabileceğini göstermiştir. Ayrıca, zeytin bitkisinde dona toleransta nişasta bozulmasının
önemli olduğu ortaya konmuştur. Enzim aktivitesi sonuçlarına göre; INV'ler ve SS enzimlerinin
aktiviteleri, çeşitlerin don toleranslarının belirlenmesinde güvenilir sonuçlar vermemekle birlikte,
-12 °C'de çarpıcı bir şekilde artmış olmaları, don toleransında etkili olduklarını düşündürmektedir.
SPS, HXK, FRK ve BAM aktiviteleri ise dona toleranslı ‘Memeli’ çeşidinde daha yüksek olmuştur.
Ayrıca karbonhidrat metabolizması ile ilişkili genlerin relatif gen ifade seviyelerinin ‘Memeli’
çeşidinde yüksek olması, bu genlerin zeytinde dona toleransta markör genler olarak
kullanılabileceğini göstermiştir.